摘要：众所周知，一氧化氮(NO)是血小板活化和粘附的有效抑制剂。排列在所有血管内壁上的健康内皮细胞显示出0.5-4^(-10)molcm^(-2)min^(-1)的NO通量，这有助于防止血栓形成。具有相当于该水平的NO通量的材料预计会表现出类似的抗血栓形成特性。在这项研究中，研究了五种掺有S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)的生物医学级聚合物，以了解它们控制聚合物内SNAP释放NO并进一步控制SNAP本身释放的潜力。Elast-eonE2As聚合物中的SNAP形成了一种廉价、均匀的涂层，可以局部输送NO（通过热和光化学反应）并缓慢释放SNAP。此外，SNAP在E2As聚合物中出奇地稳定，在7℃下储存2个月后仍保留初始SNAP的82%。将含有SNAP的E2As聚合物涂在体外循环(ECC)回路的壁上，并在体外循环兔模型中暴露于4小时血流，以检查对血小板计数、血小板功能、凝块面积和纤维蛋白原吸附的影响。4小时后，SNAP/E2As涂层环的血小板计数保持在基线的±7%，而E2As控制电路（n=4）为60±6%。与对照组相比，SNAP/E2As涂层还减少了血栓面积（分别为2.±0.6和.4±1.1像素/cm2）。结果表明，新的SNAP/E2As涂层有可能提高血管内导管的抗血栓性，移植物和其他血液接触医疗器械，与之前报道的释放NO的聚合物材料相比，表现出优异的储存稳定性。

一、简介

一氧化氮(NO)是一种内源性气体分子，起着多种关键生理作用，包括防止血小板粘附和活化、抑制细菌粘附和增殖、增强血管舒张、促进血管生成和帮助伤口愈合。NO的作用在很大程度上取决于其在生理系统中的位置及其浓度。例如，排列在健康血管内壁上的内皮细胞产生的NO表面通量估计为0.5-4.0×10^(-10)molcm^(-2)min^(-1)。许多血液接触装置的功能，包括血管移植物、支架、血管内传感器、血管内导管和体外生命支持回路，都可能因血小板活化和血栓形成而受损。改善此类装置血液相容性的一种方法是使用涂层材料，在NO释放方面模拟内皮细胞。事实上，近年来人们对开发可用于提高此类设备生物相容性的NO释放和NO生成材料产生了相当大的兴趣。

图1.(A)S-nitroso-N-acetylpenicillamine(SNAP)的结构和(B)Snitrosothiol(RSNO)分解的方案，可由金属离子（如Cu＋）、光和热催化，产生二硫化物(RSSR)产物和一氧化氮(NO)。

一氧化氮在生理条件下具有很高的反应性，因此已经研究了范围广泛的NO供体分子，这些分子具有可以储存和释放NO的官能团，用于潜在的生物医学应用。此类分子包括有机硝酸盐、金属-NO络合物、N-二氮烯二醇和S-亚硝基硫醇(RSNOs)。生理RSNOs，如S-亚硝基血红蛋白和S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)，被认为是体内NO的内源性储库。其他合成的RSNOs，例如亚硝基-N-乙酰基-L-半胱氨酸(SNAC)和S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP，图1A)已被证明具有显着的抗菌和抗血栓形成作用。还证明了RSNO既是血管扩张剂又是血小板聚集的有效抑制剂。RSNOs经历热分解释放NO并产生相应的二硫化物物质(RSSR)，如图1B所示。RSNOs的NO释放可以被金属离子（例如Cu＋）和光催化，通过在对应于40和/或nm的S-亚硝基吸收带的能量照射。有人提出，RSNOs的活性更强。作为抗血小板剂的NO源于RSNOs相对于NO的增强稳定性，以及通过含有催化位点将RSNOs转化为NO的膜蛋白在血小板表面局部从RSNOs产生NO。

将RSNOs掺入聚合物中可以扩展这些NO供体的实用性，使其可用作生物医学设备中的涂层，在血液/设备界面提供局部NO释放。几种由分散在各种聚合物基质中的小分子RSNOs组成的NO释放聚合物，包括聚乙二醇(PEG)、聚（乙烯醇）、聚（乙烯基吡咯烷酮）和PluronicF水凝胶均有报道。这些材料具有通过亲水性RSNOs从聚合物扩散到组织，从而在伤口上局部递送NO的潜在应用。事实上，每天使用含有GSNO的水凝胶已被证明可以加速伤口愈合过程。然而，从此类聚合物中快速浸出RSNOs会显着缩短NO/RSNO释放寿命，仅持续数小时。合成RSNO改性材料，其中RSNO功能共价结合到矩阵。气相二氧化硅颗粒、树枝状聚合物、聚氨酯、聚酯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、干凝胶、自组装单分子层和聚（乙烯基甲基醚-马来酸酐共聚物）(PVMMA)都经过RSNO功能改性。Ricco等人。报道了RSNO修饰的干凝胶，其释放NO长达14天，并表现出血小板和细菌粘附减少。然而，这种RSNO改性干凝胶存在合成复杂性，导致开裂和薄膜不均匀，RSNO转化效率低（三级RSNO改性干凝胶的最高40%），室温下的热不稳定性会限制它们的保质期。迄今为止报道的许多其他RSNO改性材料都表现出热和光引发的NO释放，但这些材料由于其有限的NO释放寿命、合成过程中向RSNO的低转化率而未被证明具有临床用途，或储存期间缺乏RSNO稳定性迄今为止报道的大多数NO释放材料缺乏稳定性可能会对使用此类材料的医疗设备商业化造成重大障碍，因为运输成本增加以保护产品免受热降解等。这可能会阻止NO释放材料在生物医学市场上的应用，无论它们的潜在好处如何。

据报道，另一种在聚合物/血液界面实现局部NO输送的方法是使用产生NO的涂层，其中固定催化剂（Cu（I/II）或有机硒物质）可以从内源性RSNOs中产生NO。最近，使用体外循环(ECC)兔模型对含有Cu0纳米颗粒的NO生成涂层进行了评估。然而，为了在减少血栓形成方面取得良好效果，需要连续输注SNAP以补充内源性RSNO水平。

作为连续输注RSNO物种的替代方案，在本研究中，我们研究了几种能够储存RSNO物种的生物医学聚合物。如果还使用NO生成催化剂，这种RSNO掺杂涂层可以释放NO并可能补充内源性RSNO水平。研究了五种生物医学聚合物作为SNAP储存容器的潜力。这些包括：硅橡胶（聚（二甲基硅氧烷））；Elast-eonE2As（一种聚（二甲基硅氧烷）和聚（六亚甲基氧）与亚甲基二苯基异氰酸酯(MDI)硬链段的混合软链段的共聚物）；CarboSil（一种热塑性聚氨酯共聚物，具有聚（二甲基硅氧烷）和羟基封端聚碳酸酯的混合软链段以及芳族二异氰酸酯(MDI)的硬链段）；TecoflexSG80A（一种用二异氰酸酯基二环己基甲烷封端的聚（丁二醇）聚氨酯）；和TecophilicSP-60D-60（一种脂肪族、亲水性聚醚基聚氨酯）。每个SNAP掺杂的聚合物都被检查为可以热释放NO的薄膜或涂层（在生理温度下）和/或可以用作补充内源性RSNO水平的储层（通过从聚合物快速扩散到血液中）。SNAP掺杂聚合物的特征在于它们的体外NO/SNAP释放，其中疏水性更强的聚合物预计在生理条件下具有更慢的SNAP/NO释放。据报道，Elast-eon聚合物具有出色的内在生物相容性和生物稳定性，并表现出低水平的血液蛋白粘附性。因此，进一步测试SNAP/E2As聚合物在2个月的储存期间的SNAP稳定性，以确定任何自寿命问题。新的SNAP/E2As聚合物还通过ECC兔血栓形成模型检查了潜在的生物医学应用，以评估ECC4小时后血小板计数和功能的保存以及血栓面积。

二、材料与方法

2.1.材料

N-乙酰-DL-青霉胺(NAP)、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸(EDTA)、四氢呋喃(THF)、硫酸和N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)购自SigmaeAldrich（密苏里州圣路易斯）。甲醇、盐酸和硫酸购自FisherScientific(Pittsburgh,PA)。TecophilicSP-60D-60和TecoflexSG-80A是LubrizolAdvancedMaterialsInc.(Cleveland,OH)的产品。道康宁RTV硅橡胶(SR)购自EllsworthAdhesives(Germantown,WI)。CarboSilA来自PolymerTechnologyGroup(Berkeley,CA)。Elast-eonE2As购自AorTechInternational,plc(富临塑胶可提供)。含有≥90%可凝固蛋白的人血浆纤维蛋白原是Calbiochem（加利福尼亚州拉霍亚）的产品，荧光素标记的山羊IgG（多克隆抗体）抗变性人纤维蛋白原购自MPBiomedicals,LLC（俄亥俄州索伦）。用于荧光测量的黑色聚丙烯96孔微量滴定板购自NalgeNuncInternational(Rochester,NY)。使用Milli-Q过滤器（MilliporeCorp.，Billerica，MA）用18.2MU去离子水制备所有水溶液。磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.4，含有18mMNaCl、2.7mMKCl、10μM磷酸钠、μmEDTA，用于所有体外实验。

2.2.SNAP的合成

SNAP是使用先前报告的方法的修改版本合成的。简而言之，将等摩尔比的NAP和亚硝酸钠添加到含有2MHCl和2MH2SO4的1:1水和甲醇混合物中。搅拌0分钟后，将反应容器在冰浴中冷却以沉淀绿色SNAP晶体。通过过滤收集晶体，用水洗涤，并使其风干。反应和晶体始终避光。

2..制备SNAP掺杂薄膜

通过溶剂蒸发制备含有5和10wt%SNAP的聚合物膜。对于10wt%的SNAP薄膜，通过将mg的相应聚合物溶解在THF中来制备流延溶液。聚氨酯（SP-60D-60、SG-80A、CarboSil和Elast-eonE2As）溶解在mLTHF中，SR溶解在1mLTHF中。然后将SNAP(20mg)添加到聚合物溶液中并将混合物搅拌10分钟。用SNAP(10mg)和聚合物(mg)类似地制备5wt%SNAP薄膜。将薄膜溶液浇注在特氟隆板上的特氟隆环(d=2.5cm)中，并在环境条件下干燥过夜。从母膜上切下小圆盘（d?0.7cm）并用面漆溶液（mg聚合物（未添加SNAP）在4mLTHF中）浸涂2次，并在环境条件下干燥过夜，然后在真空下干燥48小时以除去任何残留溶剂。在面涂之前记录每个小圆盘的重量。所有薄膜和薄膜溶液都避光。使用Mitutoya数字千分尺测量浸涂前后的薄膜厚度。最终的薄膜具有毫米厚的SNAP掺杂层和50毫米厚的面涂层。

2.4.SNAP/E2As涂层ECC环的制备

先前描述了体内兔研究中采用的ECC配置。简而言之，ECC由一个16号和14号IV聚氨酯血管导管（KendallMonojectTycoHealthcareMansfield，MA）、两个16厘米长1/4英寸内径(ID)聚乙烯管和一个8厘米长/8英寸内径的Tygon管创建了一个血栓形成室，由于更湍流的血流，血栓更容易形成。

由于ECC实验持续时间较短（4小时），释放NO的ECC环在E2As中仅涂有5wt%SNAP。通过将SNAP(mg)和E2As(mg)溶解在THF(15mL)中来制备SNAP/E2As溶液。E2As对照溶液由溶于THF的E2As组成（15mL中含有mg）。SNAP/E2As环首先涂上2层SNAP/E2As溶液，然后涂上一层E2As对照溶液。E2As对照环涂有2层E2As对照溶液。允许ECC环在每道涂层之间在黑暗中风干1小时。完全涂覆的ECC使用THF焊接在一起，从左颈动脉侧开始，使用16号血管导管、一根15厘米长的?英寸内径管、8厘米长的血栓形成室、第二根15厘米长的?英寸内径管，最后是14号血管导管。使用两个鲁尔锁PVC连接器将血管导管与管道连接。组装好的ECC回路在真空下干燥，同时避光至少48小时。在ECC实验之前，将环充满盐水溶液浸泡过夜，并在兔子实验前立即丢弃该溶液。

2.5.SNAP掺杂薄膜的体外表征

2.5.1.紫外线可见光谱

在室温下使用UV-Vis分光光度计（Lambda5，Perkin-Elmer，MA）在-nm的波长范围内记录所有UV-Vis光谱。SNAP的S-NO基团的存在提供了40和nm处的特征吸光度最大值，对应于π-π*和nN-π*电子跃迁。

2.5.2.SNAP从浸入PBS中的SNAP掺杂聚合物膜中扩散

将顶部涂层薄膜置于浸泡在10mMPBS（pH7.4）中的单独小瓶中，其中含有mMEDTA，以最大限度地减少任何痕量金属离子催化的SNAP分解。薄膜在室温（22℃）或7℃下避光孵育。在不同的时间点，获取1mL等份PBS的UVeVis光谱以快速测定SNAP浓度。等分试样避光并在实验期间立即放回样品瓶中。每天将薄膜置于新鲜的PBS缓冲液中。PBS中SNAP在40nm处的摩尔吸收系数确定为：εSNAP?M^(-1)cm^(-1)。PBS缓冲液用作空白。膜中剩余的SNAP百分比由浸入PBS中的SNAP量与膜中SNAP的初始量之间的差异确定。

2.5..SNAP/E2As薄膜累积释放的NO

在E2As薄膜中制备10wt%SNAP后，记录溶解在DMAc中的单个薄膜的UVeVis光谱以确定薄膜内SNAP的初始浓度（nmolSNAP/mg薄膜）。然后将等效的薄膜放入含有mLPBS(pH7.4)和μmEDTA的单独小瓶中。薄膜在各种条件下孵育：环境光下室温、环境光下7℃、黑暗中7℃、W泛光灯下7℃。这些实验是在没有任何窗户的地下室实验室中进行的，因此实验室中的荧光灯被称为环境光。每天将薄膜置于新鲜的PBS中。在不同的时间点，将薄膜溶解在DMAc中以快速测定薄膜中存在的SNAP。释放的NO量是根据不同时间点分解的SNAP量间接确定的。随时间释放的累积NO([NO]t)是通过薄膜中SNAP的初始量([SNAP]0)与时间t([SNAP]t)的SNAP量之间的差异计算的:[NO]t?[SNAP]0[SNAP]t（浓度以nmol/mg胶片表示）。该计算基于这样一个事实，即SNAP的40nm吸收带的衰减与SeNO键的均裂裂解和伴随的NO释放直接相关。DMAc中SNAP在40nm处的摩尔吸收系数确定为：εSNAP?M^(-1)cm^(-1)。DMac用作空白。

2.5.4.NO释放测量

使用Sievers化学发光一氧化氮分析仪(NOA)(Boulder,CO)测量从薄膜释放的一氧化氮。将薄膜置于浸没在含有mMEDTA的PBS(pH7.4)中的样品容器中。一氧化氮不断从缓冲液中清除，并使用N2吹扫气体和起泡器从顶部空间吹扫到化学发光检测室中。透明玻璃样品容器用于环境光和光引发的NO释放实验。将W卤素泛光灯（GE型号）用作广谱光源以启动NO释放，并将其放置在距离样品池60厘米处以进行光解实验。在与NOA测量相同的条件下（环境光或7℃的W泛光灯照射），将薄膜在PBS中孵育。

2.5.5.SNAP/E2As稳定性研究

将SNAP/E2As薄膜（由10wt%SNAP组成）在以下条件下放置在装有干燥剂的小瓶中：有环境光的室温、避光室温、避光7℃、避光50℃、避光冰箱（20℃）。在2个月的不同时间点，将薄膜溶解在DMAc中并记录UVeVis光谱以确定与初始10wt%SNAP相比，薄膜中剩余的%SNAP。

2.5.6.体外纤维蛋白原吸附试验

体外纤维蛋白原吸附免疫荧光测定以96孔格式进行。用于制备ECC回路的SNAP/E2As和E2As对照聚合物溶液也用于包被96孔微量滴定板的微孔，并在与ECC回路相同的条件下干燥。简而言之，用不含CaCl2和MgCl2的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dPBS)(GibcoInvitrogen,GrandIsland,NY)将人纤维蛋白原稀释至mg/mL，相当于人血浆浓度，然后用于吸附实验。每孔加入μL该溶液，包被的孔与该溶液在7℃下孵育1.5h。接下来是八个洗涤步骤，每次洗涤都使用洗涤缓冲液(μL)，其中包含10倍稀释的AbDSerotecBlockACE缓冲液（罗利，北卡罗来纳州），其中含有0.05%吐温20（CalbiochemLaJolla，CA）。为阻断非特异性抗体结合，将包被孔与μL封闭缓冲液（4倍稀释的SerotecBlockACE缓冲液）在7℃下孵育0分钟。用洗涤缓冲液（每孔μL）冲洗次后，在Synergy2荧光酶标仪（BiotekWinooski，VT）上在nm（激发）和nm（发射）下对板进行背景荧光测量。

2.6.兔ECC血栓形成实验

所采用的所有动物处理和外科手术均由大学动物使用和护理委员会根据大学和联邦法规批准。本研究共使用了8只新西兰白兔（Covance，BattleCreek，MI）。所有兔子(2.5e.5kg)最初都通过肌内注射5mg/kg甲苯噻嗪(AnaSed-LloydLaboratoriesShenandoah,Iowa)和0mg/kg盐酸氯胺酮(Hospira,Inc.LakeForest,IL)进行麻醉。维持麻醉是通过机械通气以1.5-%的速度吸入异氟醚进行的，机械通气是通过气管切开术完成的，并使用A.D.S.0呼吸机（EnglerEngineeringCorp.Hialeah,FL）。吸气峰值压力设置为15cmH2O，呼吸机流速设置为8L/min。为了帮助维持血压稳定，以10mL/kg/h的速度静脉输注乳酸林格氏液。为了监测血压和收集血液样本，使用16号IV血管导管（Jelco，强生公司，辛辛那提，俄亥俄州）对兔子的右颈动脉进行插管。用Series0Monitor(MarquetteElectronicsMilwaukee,WI)监测血压和衍生心率。用直肠探头监测体温，并使用水套加热毯将体温维持在7℃。在放置动静脉(AV)定制体外循环(ECC)回路之前，分离兔左颈动脉和右颈外静脉，并进行基线血流动力学以及动脉血pH、PCO2、PO2、使用ABL血气分析仪和OSM血氧仪（RadiometerCopenhagen，DK）测量总血红蛋白和高铁血红蛋白。此外，收集基线血样用于血小板和总白细胞(WBC)计数，这些计数在CoulterCounterZ1(CoulterElectronicsHialeah,FL)上测量。使用DadeBehringBCS凝血分析仪（SiemensDeerfield，IL）测定血浆纤维蛋白原水平，使用Hemochron血液凝固系统型（InternationalTechnidyneCorp.Edison，NJ）监测活化凝血时间（ACT），使用Chrono-Log光学聚集计型（哈弗敦，宾夕法尼亚州）评估血小板功能。

基线血液测量后，通过为ECC流入左颈动脉和为ECC流出的右颈外静脉插管，将AV定制ECC放置到位。通过松开ECC的动脉和静脉侧开始流过ECC，并用超声波流量探头和流量计（TransonicHTIthaca，NY）监测回路中的血流。动物在实验过程中没有进行全身抗凝。

在ECC上4小时后，将电路夹紧，从动物身上取下，用60mL盐水冲洗并排干。对ECC较大管道（即血栓形成室）中的任何残留血栓进行拍照，并使用美国国立卫生研究院（马里兰州贝塞斯达）的ImageJ成像软件对血栓的程度进行定量。在安乐死之前，所有动物都给予U/kg肝素钠剂量以防止坏死性血栓形成。使用一定剂量的FatalPlus（10mg/kg戊巴比妥钠）（VortechPharmaceuticals，Dearborn，MI）对动物实施安乐死。所有动物在被安乐死后进行大体尸检，包括检查肺、心脏、肝脏和脾脏以寻找任何血栓栓塞事件的迹象。

2.7.血液取样

兔全血样本收集在非抗凝1cc注射器中用于ACT，并收集在.2%柠檬酸钠真空采血管（Becton，Dickinson。FranklinLakes，NJ）中，用于细胞计数和聚集测定，体积为cc，和含有40U/mL肝素钠（APPPharmaceuticals,LLCSchaumburg,IL）的1cc注射器用于血气分析。在ECC血流开始后，每小时收集一次血样，持续4小时，用于这些体外测量。样品在收集后2小时内使用，以避免血小板、单核细胞或血浆纤维蛋白原的任何活化。

2.8.血小板聚集度测定

基于Born的浊度法，使用Chrono-Log光学聚集仪测定兔血小板聚集。简而言之，收集柠檬酸盐血液（1:10血液与.2%柠檬酸钠溶液）（6mL），并通过以×g离心15分钟获得富含血小板的血浆（PRP）。将去除PRP的血样再次以×g离心15分钟获得贫血小板血浆(PPP)，用作聚集空白。PRP在7℃下孵育10分钟，然后加入25mg/mL胶原蛋白(Chrono-PAR#85Havertown,PA)。在加入胶原蛋白分钟后，使用Chrono-LogAggrolink软件测定聚集百分比。

2.9.统计分析

数据表示为平均值±SEM（平均值的标准误差）。通过使用学生t检验的方法比较来分析各种SNAP/E2As和E2As控制聚合物组之间的比较。p0.05的值被认为对所有测试具有统计学意义。

三、结果与讨论

.1.各种掺杂SNAP的聚合物薄膜的初步体外表征

将SNAP掺杂到所有五种生物医学聚合物中，都产生了均匀透明的绿色薄膜，没有任何可观察到的相分离。10wt%的SNAP薄膜每毫克聚合物薄膜储存大约0.42mmol的SNAP（或6mmol/cm2）。SNAP从含有5和10wt%SNAP的各种聚合物膜扩散到PBS中，使用紫外可见吸收进行监测。如图2所示，它说明了计算出的薄膜中剩余的SNAP百分比，在室温和7℃下浸泡在PBS中的第一天，所有SNAP从SG80A和SP-60D-60聚合物薄膜中扩散出来。SP-60D-60聚合物是亲水性的，吸水率为w60wt%，而SG80A更疏水，吸水率为w6wt%（参见支持信息中的表S1）。在浸泡的最初2小时内，所有SNAP都会留下亲水性更强的SP-60D-60聚合物，而疏水性更强的SG80A在24小时后会浸出所有SNAP。SNAP从聚合物中的扩散在升高的温度（室温与7℃）下发生得更快，其中较高的温度允许聚合物更快地吸收水。由于SP-60D-60和SG80A聚合物的SNAP快速损失，在浸泡的第一天（第0天）通过化学发光（使用NOA）观察到非常大的NO初始爆发，并且薄膜没有表现出SNAP/一天后不释放（数据未显示）。因此，这两种聚合物仅能快速释放NO/SNAP，并不适合长期释放NO/SNAP。

图2.在室温、22℃(A)或7℃(B)黑暗条件下，在4mLPBS中浸泡不同时间后，薄膜（最初用10wt%SNAP制备）中残留的SNAP百分比。数据基于在40nm处监测到的从各种聚合物中浸出到PBS中的SNAP量与薄膜中掺杂的SNAP初始量之间的差异。数据是平均值±SEM(n=)。

相比之下，一天后，硅橡胶、CarboSil和E2As聚合物扩散到浸泡缓冲液中的SNAP量明显减少（见图2）。对于所有这三种聚合物，在浸泡的第一天观察到SNAP浸出的初始爆发，对应于聚合物快速吸水。该初始爆发是掺入薄膜中的总SNAP分子的10%。在随后几天的浸泡过程中，少量SNAP继续从这些聚合物中浸出。硅橡胶、CarboSil（一种热塑性有机硅-聚碳酸酯聚氨酯）和E2As（一种基于硅氧烷的聚氨酯弹性体）都是疏水性聚合物，因为它们的PDMS含量高，而且吸水率最低（参见支持信息中的表S1）。据报道，SNAP具有轻微的疏水性。因此，SNAP应该优先保留在疏水性更强的聚合物相中。此外，由于这些聚合物的吸水率极低，这些聚合物的疏水性在限制SNAP扩散到缓冲液中也起着重要作用。

还通过NOA测量研究了三种SNAP掺杂聚合物的热引发和光引发的NO释放。使用广谱W泛光灯可以打开/关闭所有种电影类型的一氧化氮释放。如图A所示，在黑暗中或在环境实验室灯光下，薄膜释放的NO几乎没有差异，因为环境荧光实验室照明不会发出负责分解RSNO的波长（40或nm）。荧光灯发出离散波长的光，而W卤素泛光灯是一种广谱光源。对于所有三种聚合物，NOA检测到的用W泛光灯连续照射的薄膜的总NO释放量约为掺杂到薄膜中的SNAP的%。通过在7℃下用W泛光灯连续照射并监测NOA释放的NO，检查了这三种薄膜的光引发NO释放（图B）。

图.(A)10wt%SNAP/E2As薄膜在7℃黑暗、环境光和W泛光灯下的NO释放行为。(B)硅橡胶(SR)、CarboSil和Elast-eonE2As薄膜中10wt%SNAP在7℃下用W泛光灯连续照射时的NO释放。(C)在7℃环境光(amb)或W泛光灯下，Elast-eonE2As薄膜中5和10wt%SNAP的NO释放。数据是平均值±SEM(n=)。

SNAP掺杂的E2As和CarboSil薄膜在天的时间内表现出光致NO通量逐渐降低，而基于SR的薄膜在相同条件下仅释放NO2天。在7℃环境光下孵育的所有三种类型的薄膜在浸泡的第一天都产生了NO的初始爆发，对应于SNAP释放到溶液中，在随后的几天里，NO通量为1-2×10^(-10)molcm^(-2)min^(-1)，仍然可能对抑制血小板功能和杀灭细菌有用。在W泛光灯下，由E2As中10wt%SNAP组成的薄膜最有希望释放NO。因此，E2As中SNAP的wt%发生了变化，并进行了更详细的检查（图C）。5wt%SNAP/E2As薄膜的NO释放和SNAP浸出模式相似，但NO释放发生的时间较短。Elast-eonE2As聚合物的生物稳定性和生物相容性与SNAP的NO释放相结合，使该配方对进一步的体外研究和潜在的生物医学应用最具吸引力。

.2.SNAP/E2As制剂的长期NO释放

对SNAP/E2As薄膜进行了体外研究，以检查这些薄膜的长期NO释放和SNAP浸出。SNAP/E2As薄膜随时间释放的NO是根据聚合物相内分解的SNAP量确定的（即，通过测量在给定时间点溶解薄膜后剩余的SNAP）。10wt%薄膜中SNAP的初始浓度为nmolSNAP/mg薄膜。图4A显示了1.0mMSNAP溶液、10wt%SNAP的E2As薄膜再溶解在N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中，以及E2As溶解在DMAc中的UVeVis光谱。由于SNAP的热和/或光化学分解，当薄膜浸泡在PBS中时观察到40nm吸收带的减少，并且基于该吸光度减少的累积NO释放如图4B所示。在浸泡的第一天，薄膜显示出初始的NO爆发（图2），这对应于热分解以及SNAP从薄膜中扩散出来。在室温下浸泡的薄膜具有最低的NO释放通量。然而，在7℃的黑暗或环境光下培养的薄膜表现出比室温下的薄膜更高的NO释放。这是由于SNAP的热分解增加所致。暴露在环境光下的薄膜产生与浸泡在黑暗中的薄膜基本相同的NO释放曲线。在7℃下用W泛光灯连续照射的SNAP/E2As薄膜释放的一氧化氮仅释放d，因为它们较高的NO通量会迅速耗尽SNAP储层。这些薄膜可以通过SNAP的热分解和光引发分解提供NO释放。

图4.(A)10wt%SNAP/E2As薄膜、1.0mMSNAP和溶解在N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中的E2As的紫外可见光谱。(B)在各种条件下在PBS中孵育的10wt%SNAP/E2As薄膜的累积NO释放：室温（22℃）有环境光，暗处7℃，环境光7℃，W泛光灯下7℃。数据是平均值±SEM(n=)。

为了更好地了解SNAP/E2As涂层的NO释放机制，在20天的时间内监测了SNAP扩散到PBS中的情况。如图5A所示，含有10wt%SNAP的薄膜在7℃时在第一天表现出SNAP浸出的初始爆发。在此初始爆发后，少量SNAP继续从E2A缓慢扩散，直到SNAP储层几乎耗尽（在第20天仍有可测量的SNAP浸出量）。从胶片中浸出的SNAP总摩尔数约占10%。在20天期间释放的NO总量的27%（通过NOA测量检测）（参见图5B），因此大部分NO释放可归因于存储在E2As薄膜内的SNAP。此外，还评估了聚合物顶涂层的数量对SNAP损失的影响。没有任何面漆的SNAP掺杂E2As薄膜比具有至少2层面漆的薄膜表现出更高水平的SNAP扩散到缓冲液中（参见支持信息中的图S1）。面漆的厚度允许控制SNAP从聚合物储层中的扩散速率。

图5.(A)在黑暗中浸泡在1mLPBS中的10wt%SNAP掺杂的E2As薄膜的SNAP扩散，在室温（RT，22C）或7℃下在40nm处监测。(B)10wt%SNAP掺杂的E2As薄膜在7℃黑暗中浸泡在PBS中的累积SNAP浸出和累积NO释放（基于基于NOA或基于SNAP的NO释放数据）的比较。从SNAP掺杂的E2As薄膜中释放一氧化氮可能是由于SNAP在聚合物相中的热和/或光化学分解，或者是由于SNAP渗入水相。对于SNAP掺杂的E2As薄膜，大约27%的NO释放归因于SNAP浸出。

由于光解或热效应导致NO损失，SNAP分解为NO和有机基团，随后形成N-乙酰青霉胺(NAP)的二硫化物二聚体。NAP是一种众所周知的重金属螯合剂，临床上用于治疗甲基汞和铜中毒。的确，NAP已经使用了将近半个世纪。作为重金属中毒治疗的一部分，它的医学用途已在医学药理学课程中得到广泛教授，它还被用于防止自由基引起的器官损伤。因此，如果建议的材料最终用于临床应用，则E2As聚合物涂层中NAP或NAP二硫化物的一些轻微损失不太可能产生任何毒性问题。

..SNAP/E2As薄膜的稳定性研究

还评估了在干燥储存期间掺杂在E2As聚合物中的SNAP的稳定性，以确定该材料的潜在保质期，以及储存和运输的任何热控制要求。E2As中掺入的SNAP在储存过程中可能会发生热分解或光化学分解，从而限制了使用时可用的NO释放能力。因此，SNAP/E2As薄膜在室温和7℃的干燥剂下避光储存。这些稳定性研究以与累积NO释放实验类似的方式进行，其中将薄膜溶解在DMAc中以确定在不同时间点（如第2.5.节所述）残留在聚合物中的SNAP量。结果表明，在室温或7℃下储存2个月后，SNAP在E2As聚合物基质中是稳定的。将10wt%SNAP薄膜在黑暗中的冰箱(20℃)中储存2个月，保留了96%的初始SNAP种类，而室温下为89%，在7℃下储存的薄膜为82%（见图6）).此外，在50℃下储存的SNAP薄膜在储存1天后保留了99%的初始SNAP，表明这些薄膜中的SNAP可能会承受临床设备应用所需的环氧乙烷灭菌（1-6小时）期间使用的略微升高的温度。由于硫原子周围的空间位阻，三级RSNO（如SNAP）已知比初级RSNO具有更高的稳定性。SNAP提高的热稳定性与E2As聚合物的稳定作用相结合，使SNAP/E2As材料具有出色的储存稳定性。

图6.在各种温度和光照条件下，使用干燥剂干燥储存的E2As薄膜中10wt%SNAP的稳定性。将薄膜溶解在DMAc中，以快速确定在不同时间（与初始水平相比）剩余的SNAP量，如通过UVeVis在40nm处监测的那样。数据是平均值±SEM(n=)。

RSNO的稳定性以前曾报道过含有此类NO供体的粘性聚合物基质，包括聚（-乙二醇）、PluronicF水凝胶和聚（乙烯醇）和聚（乙烯基吡咯烷酮）。RSNO根据以下反应顺序分解：

聚合物基质的粘度对键断裂和自由基对重组提供笼效应。此外，粘性聚合物基质还限制了自由基物种的扩散，有利于成对重组以改造RSNO。因此，E2As聚合物不仅限制了SNAP扩散到PBS中，而且似乎还提供了额外的稳定作用以降低SNAP分解速率。

.4.SNAP/E2As涂层ECC环及其对兔血流动力学的影响

为了确定SNAP/E2A作为抗血栓涂层的潜在益处，进行了一项短期ECC研究，以观察4小时血流期间这种新涂层释放的NO对血小板和血栓区域的影响。制备了在E2A中涂有5wt%SNAP的活性ECC环（图7）和仅涂有E2A的对照环。由于ECC实验的持续时间较短，因此在这些测试中使用了5wt%的SNAP。如上所述，SNAP/E2As涂层在浸泡的第一天有一个初始的SNAP扩散到溶液中。为了在短期ECC实验期间减少这种突发的影响，首先将所有环路浸泡在盐水中过夜，并在ECC实验之前丢弃浸泡溶液。在血液暴露前（在盐水中浸泡过夜后），使用NOA测量从涂层ECC环样品中释放的一氧化氮的NO释放。SNAP/E2As涂层环的NO释放保持平均通量约为2×10^(-10)molcm^(-2)min^(-1)4h（在7℃环境光下）。暴露于流动的血液4小时后，ECC环路在另外1小时内仍表现出至少1.5×10^(-10)molcm^(-2)min^(-1)的NO通量（参见支持信息中的图S2）。

图7.体外回路(ECC)管的示意图，先涂有5wt%SNAP/E2As，然后再涂上E2As面漆。

SNAP/E2As涂层ECC回路的血流动力学效应也在兔ECC模型的4小时血液暴露期间进行了监测。在第一个小时内，SNAP/E2A和控制回路的平均动脉压(MAP)显着下降，分别降至5±2和46±2mmHg。通过连续IV液体维持，MAP维持在这些水平4小时。对于SNAP/E2AsECC电路，ECC血流量下降并保持在64±5mL/min，但在4小时内保持在基线水平（76±6mL/min）用于控制。SNAP/E2As电路的MAP下降和血流变慢可能是由于SNAP从涂层扩散到血液中的血管舒张作用。心率在4小时内保持不变，SNAP/E2A和控制ECC循环之间没有显着差异，平均为±2次/分钟。SNAP/E2As和控制回路的活化凝血时间在4小时内增加，可能是由于血管内液体增加（血液稀释效应）。使用SNAP输注观察到对MAP和流速的类似影响。

.5.SNAP/E2As涂层对兔血小板功能和血栓形成的影响

通过记录血小板计数和血浆纤维蛋白原水平（图8）评估整个4小时ECC中的血小板活化和功能，这两者都针对由于添加的IV液体引起的血液稀释以及血小板聚集百分比进行了校正。SNAP/E2As和E2As控制电路的基线血小板计数(×10^8platelets/mL)分别为.5±0.6和4.8±0.5。对于SNAP/E2As电路，血小板计数最初略有上升，并在ECC4小时结束时维持在基线水平的±7%。控制电路的血小板计数表现出随时间变化的血小板损失，4小时后降至基线的60±6%。血小板功能聚集的百分比通过PRP的离体胶原刺激来确定，并通过光学浊度测量。通过SNAP/E2As和控制电路从循环中提取的血液中的血小板在4小时血液暴露期间对胶原蛋白刺激的血小板聚集表现出相似的反应，均保持56±12%（基线值为68±6%）。

图8.在兔血栓形成模型中4小时血液暴露期间，5wt%SNAP/E2As涂层对血小板计数（例如，消耗）的时间依赖性影响。数据为平均值±SEM(n=4)。

血浆纤维蛋白原水平维持在控制回路的基线水平（参见支持信息，图S）。对于SNAP/E2As电路，ECC的第一个小时内血浆纤维蛋白原水平下降到基线水平的8%，并在4小时ECC期间保持在该水平。血浆纤维蛋白原水平的这种降低可归因于纤维蛋白原与表面的结合，如体外纤维蛋白原测定所示（参见支持信息中的图S）。令人惊讶的是，即使纤维蛋白原在SNAP/E2As涂层上的吸附增强，这些材料的血小板损失仍然明显少于对照，这表明产生的NO水平克服了通常会增强血小板活化的纤维蛋白原吸附增强。为了确定ECC回路（即/8英寸内径Tygon?管，ECC回路内长度为8厘米）的血栓形成室中血栓的差异形成，血液暴露4小时后进行二维(2D)图像分析。使用ImageJ软件分析血栓区域，并表示每个血栓形成室中血栓形成的二维区域（像素/平方厘米）。对血栓面积进行了定量，数据如图9所示。与对照组相比，SNAP/E2As电路的血栓面积显着减少，尽管E2As对照组的血栓面积也相对较低，这可能是由于E2As聚合物的固有生物相容性增强所致。

图9.在兔血栓形成模型中4小时血液暴露后，SNAP/E2A和对照ECC上血栓形成的二维表示，使用NIH的ImageJ软件进行量化。数据是平均值±SEM(n=4)。

新的SNAP/E2As涂层的影响之一是SNAP扩散到血流中引起的低血压，尽管静脉输液的联合给药能够抵消这种情况。本研究中使用的ECC回路有1个面漆层；然而，可以添加额外的面漆层（参见支持信息中的图S1）以限制SNAP浸出并进一步降低观察到的降压作用。还可以使用高度交联聚合物的薄外层来进一步延缓SNAP从E2As聚合物中的浸出。据报道，SNAP的应用会导致低血压、高血糖和胰岛素分泌受损，并降低细胞活力。内源性硫醇和超氧化物歧化酶将减少许多这些不利影响。然而，母体硫醇N-乙酰基-DL-青霉胺(NAP)已在临床上用于治疗汞中毒和胱氨酸尿症，且副作用极小。尽管此处研究的SNAP/E2As涂层确实表现出低血压作用，但涂层提供的SNAP每日水平远低于报告的水平，从而导致上述其他不良副作用。未来的涂层应使用更多亲脂性RSNO，或将SNAP/E2As涂层与ECC管内表面上的固定催化剂相结合，以在RSNO进入流动的血液之前对其进行分解，从而实现NO的完全局部输送。

四、结论

在这项研究中，已经表明Elast-eonE2As聚合物是一种出色的基质，可用作SNAP的储层，所得薄膜可用于控制释放NO和SNAP。SNAP从聚合物薄膜中缓慢扩散，并且当血液流经ECC环路时，可以通过光和/或热分解启动薄膜/涂层中的NO释放。光（以手术灯、LED、光纤等形式）可能被用于在临床环境中施用更高剂量的NO。稳定性研究表明，SNAP在E2As基质中非常稳定，即使在7℃下储存长达2个月，也证明了使用这种材料制成的运输设备的保质期和运输潜力无需热控制。此外，我们发现E2As中的SNAP也能在50°C下存活至少一天，这表明使用SNAP/E2As涂层的医疗器械可以进行环氧乙烷灭菌。虽然E2As聚合物本身具有出色的先天生物相容性，但将SNAP结合到E2As聚合物基质中可以控制NO/SNAP的递送，从而进一步改善聚合物的血液相容性。SNAP/E2As涂层ECC环在4小时ECC血流期间显着保留了血小板计数和功能，同时与相应的E2As涂层控制环相比，还减少了凝块面积。在Elast-eonE2As聚合物薄膜/涂层中加入SNAP提供了一种简单的局部递送NO/SNAP的方法，并且有可能改善各种血液接触医疗设备的血液相容性，而没有洗脱任何有毒前体的风险，因为NAP已经作为批准的治疗剂使用。

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